PCR

PCR - Polymerase-Kettenreaktion

Einführung	"Jack the Ripper durch Speicheltest überführt", hätte der Aufmacher einer londonder Zeitung lauten können, wäre Scotland Yard 1888 in der Lage gewesen, die Metoden der Gentechnik zu nutzen. Bereits Zellpartikel enthalten Reste von DNA, die ausreichen, um vom Täter einen "genetischen Fingerabdruck" zu erstellen. Die Biochemiker benötigen dafür große Mengen Täter-DNA , die sie mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction, PCR) millionfach vervielfältigen, um sie anschießend analysieren zu können. Verschiedene PCR-Techniken werden neben der Gentechnik angewendet in der medizinischen Diagnostik, Paläontologie und in der Kriminalistik (forensische Medizin) Die PCR ist der Verdopplung der DNA (Replikation) ähnlich. Eine DNA-Polymerase synthetisiert den neuen DNA-Einzelstrang (semikonservative Replikation). Für den Synthesebeginn wird ein Primer (Startermolekül) benötigt. Die Polymerase liest den Matrizenstang in 3´-> 5´ Richtung ab; die Nukleotide binden (hybridisieren) aufgrund komplementärer Basenpaarung an die Matrizen-DNA. Die Vervielfachung erfolgt durch zyklische Wiederholung der Replikation.
Reaktionsverlauf Denaturierung Hybridisierung DNA-Polymerisation Wissenswertes Begriffe DNA-Eigenschaften Primer Taq-Polymerase
Denaturierung	Durch Erhitzen auf 90-100°C wird die DNA geschmolzen. Die DNA Einzelstränge werden anschließend verdoppelt.
Hybridisierung	Wenn sich das Reaktionsgemisch auf 50°C abkühlt, binden die Primer mit den komplementären Sequenzen der Matrizen-DNA.
DNA-Polymerisation	Am 3´-Ende des Primers beginnen die Taq-Polymerase-Enzyme mit der Synthese der neuen Einzelstränge (neuer Komplementärstrang). Bei der für die Polymerasen optimalen Temperatur von ca. 72°C arbeiten beide Enzyme fortlaufend, da sie nicht mit der Laufrichtung einer Helicase ablesen müssen, OKAZAKI-Fragmente fallen deshalb nicht an.(Vergleiche: DNA-Replikation). Nach Beendigung der Polymerisation beginnt der Zyklus von vorn. Die Temperatur wird wieder erhöht, die Doppelstänge denaturieren; es erfolgt die Abkühlung, die Primer hybridisieren; die Polymerisation schließt sich an usw. Bei jedem Zyklus wird die Anzahl der DNA-Moleküle verdoppelt. Die PCR kann so lange ablaufen, bis die in der Lösung vorhandenen Taq-Polymerasen nicht mehr ausreichen, um alle Primer zu belegen.
Wissenswertes	Die PCR ist vollständig automatisiert. Es können bis zu 25 Zyklen hintereinander durchgeführt werden. Der DNA Doppelstrang ist dann ca. 4.Millionen Mal kopiert. Die Länge der DNA-Moleküle ist aus technischen Gründen begrenzt. Obwohl die Fehlerquote bei den Ablesevorgängen durch die Taq-Polymerase sehr hoch ist, erfüllen die gewonnnen Moleküle die notwendigen Anforderungen. Schuld am fehlerhaften Aufbau ist die Bakterien-Polymerase, die sich durch ihre Wirkungsweise von den Polymerasen der Eukaryonten unterscheidet, worauf hier nicht weiter eingegangen werden soll.
Eigenschaften der DNA	Einzelstänge der DNA sind über Wasserstoffbrückenbindung miteinander verbunden: komplementäre Basenpaarung die Wasserstoffbrücken lösen sich bei Temperaturen zwischen 90 und 100°C: Schmelzpunkt die DNA liegt anschließend als Einzelstrangmolekül vor: Matrizenstrang
Die Primer	synthetisch hergestellte Startermoleküle aus 15 - 20 Nukleotiden es ist deshalb notwendig die DNA-Sequenz zu kennen, um die entsprechenden Primer herzustellen, so dass sie an den benötigten Sequenzen binden Primerpaar arbeitet entgegengesetzt
Die Taq-Polymerase	Aufgrund des Schmelzpunktes der DNA funktioniert die Polymerase-Kettenreaktion nur bei hohen Temperaturen. Somit wird eine Polymerase benötigt, die bei hohen Temperaturen noch Ihren Dienst erfüllt. Gefunden wurde sie im Bakterium Thermus aquaticus, das in heißen Quellen lebt und dessen Stoffwechsel angepaßt ist an Temperaturen um die 100°C. Die für die Kettenreaktion notwendige Taq-Polymerase ist extrem hitzebeständig mit einem Temperaturoptimum von ca. 72°C. Sie kann Temperaturen von 95°C problemlos überstehen.

Begriffe

Hybridisierung